摘要：
目的 通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7),并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化.方法 针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA),将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞,利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆.利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定.通过细菌计数测定HMGB2-/-Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2-/-Raw264.7促炎因子分泌情况.组间比较采用t检验.结果 利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株,HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达,HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较,差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15,t=0.17,P＞0.05),但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)％比(32.33±6.11)％,t=5.62,P＜0.01];KP 感染 HMGB2-/-Raw264.7,促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08)pg/ml 比(111.70±8.50)pg/ml,t=5.00,P＜0.01;(65.67±9.87)pg/ml 比(128.00±30.61)pg/ml,t=3.36,P＜0.01;(72.67±9.07)pg/ml 比(95.00±5.29)pg/ml,t=3.68,P＜0.05].结论 通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株,验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响.
